[转]EGFR基因突变L861Q在非小细胞肺癌中的临床意义

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研究背景:

非小细胞肺癌(NSCLC)由于其高发病率和高病死率成为世界性难题,近年来出现的靶向治疗为NSCLC患者提供新的治疗思路。表皮生长因子受体(EGFR)突变是靶向治疗是否有效的关键所在,酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)可以延长常见敏感突变患者(del-19, L858R)的非疾病进展生存期(PFS)。然而EGFR罕见突变L861Q对靶向TKIs药物治疗敏感性尚不明确,需要进一步研究。

研究目的:

1、基础实验方面,通过取得大量纯度较高的EGFR野生型和各突变型目的蛋白,体外分析小分子TKIs药物与EGFR突变蛋白的结合情况,探索EGFR突变蛋白的激酶活性以及小分子药物抑制效果。

2、临床随访方面,探索L861Q突变患者临床特点和预后情况,并分析该突变患者对TKIs药物靶向治疗的敏感性。

研究方法：

1、基础实验部分：通过NCBI检索获得野生型EGFR蛋白696-1022区域对应的截短体基因,PCR扩增后连接至载体质粒。设计各突变蛋白基因引物,PCR获得含有本研究目的基因的重组质粒。之后利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将目的基因重组至昆虫真核细胞sf9中,大量传代培养sf9细胞,之后破碎细胞获得目的蛋白,通过镍柱纯化和分子筛层析纯化,最终获得大量纯度高的野生型和各突变性EGFR目的蛋白。下一步,利用取得的目的蛋白进行体外SPR实验初步分析小分子TKIs药物与EGFR目的蛋白的亲和力情况。之后通过蛋白激酶实验分析EGFR目的蛋白的激酶活性及TKIs药物的抑制效果。

2、临床随访部分：回顾性收集全国范围内5125例在2009-2012年接受基因突变检测的肺癌患者和北京协和医院489例在2009-2014年接受基因突变检测的肺癌患者,最终确定了6例含有L861Q突变的患者。针对6例患者收集临床资料,包括性别、年龄、吸烟史、病理类型、肿瘤分期、治疗情况等,并随访生存期。最后分析L861Q突变患者的临床特点和靶向治疗敏感性。

研究结果

1、基础实验部分：经过提纯浓缩获得了500ul浓度2.5mg/ml的野生型EGFR蛋白、500ul浓度200ug/ml的EGFR-L858R突变蛋白、800ul浓度500ug/ml的EGFR-L861Q突变蛋白、500ul浓度315ug/ml的EGFR-L861Q/G719A联合突变蛋白。之后的SPR实验未能拟合计算出亲和力常数。激酶实验部分证实野生型和各突变型EGFR均具有激酶活性,且活性从高到低依次为：L858RL861Q/G719A L861QG719AWT。

2、临床随访部分：全国范围的5125例肺癌患者和北京协和医院随访的489例肺癌患者中,EGFR突变率分别为36.2%(1854/5125)和44.2%(216/489),其中联合突变比例分别为7.2%(160/2208)和6.02%(13/216)。本研究的L861Q突变占总突变的比例分别为0.27%(5/1854)和0.46%(1/216),且所有L861Q突变均以联合突变形式出现,L861Q联合突变比例为100%。其中最常见的联合突变为L861Q和G719A联合,占66.7%(4/6)。L861Q患者初期使用吉非替尼治疗有效,肿瘤稳定无进展,4-5个月出现耐药,改用厄洛替尼无效。

结论

1、成功获得大量纯度高的EGFR野生型及研究的各突变型目的蛋白。
2、本研究EGFR-L861Q突变蛋白具有激酶活性,L861Q突变为致癌突变；各目的蛋白激酶活性从高到低为：L858RL861Q/G719AL861QG719AWT。
3、EGFR-L861Q突变患者初期吉非替尼靶向治疗有效,但很快出现耐药(4-5个月),之后改用厄洛替尼无效。